Straipsnis Technologinių veiksnių įtaka penicilino kiekiui gaminant pieno produktus

  • Bibliografinis aprašas: Antanas Šarkinas1), Sigita Urbienė2), Andrius Šarka2), Lina Sasnauskaitė2), „Technologinių veiksnių įtaka penicilino kiekiui gaminant pieno produktus“, @eitis (lt), 2016, t. 725, ISSN 2424-421X.
  • Ankstesnis leidimas: Antanas Šarkinas, Sigita Urbienė, Andrius Šarka, Lina Sasnauskaitė, „Technologinių veiksnių įtaka penicilino kiekiui gaminant pieno produktus“, Žemės ūkio mokslai, 2011, t. 18, nr. 1, p. 22–34, ISSN 1392-0200.
  • Institucinė prieskyra: 1) Kauno technologijos universiteto Maisto institutas, 2) Lietuvos žemės ūkio universitetas.

Santrauka. Difuzijos į agarą metodu ištirta pieno perdirbimo technologinių veiksnių įtaka antibiotiko penicilino aktyviajai medžiagai. Pieno mėginiai su žinoma penicilino aktyviosios medžiagos koncentracija buvo veikiami tokiais technologiniais veiksniais: pasterizuojami keičiant pasterizavimo temperatūrą nuo 63 iki 80 °C; keičiamas laikymo laikas nuo 0 iki 15 min., esant 85 °C temperatūrai, homogenizuojami, laikomi 7–8 °C temperatūroje 72 val., užšaldomi (–20 °C) ir atšildomi (+10 °C). Taip pat ištirti penicilino veikliosios medžiagos pokyčiai biotechnologinių procesų metu rauginant mėginius su skirtingais raugais (DT 1000 l; YC-380; CHN-19). Penicilino aktyviosios medžiagos pokyčiams įvertinti panaudotas mikrobiologinis difuzijos į agarą metodas nustatant slopinimo zonų skersmenį. Slopinimo zonų skersmens pokyčiai panaudojant testavimo kultūras Bacillus subtilis ir Micrococcus luteus netiesiogiai parodė penicilino aktyviosios medžiagos kiekio sumažėjimą. Atlikus tyrimus nustatyta, kad pieno mėginius laikant 8 °C temperatūroje, penicilino veikliosios medžiagos kiekis per 72 val. sumažėja apie 6,6 %.

Išaiškinta, kad terminio pieno mėginių apdorojimo metu penicilino veiklioji medžiaga kinta – mažėja. Sumažėjimas priklauso nuo temperatūros. Kuo aukštesnė mėginių apdorojimo temperatūra, tuo labiau veiklioji medžiaga sumažėja. Paveikus 80 °C temperatūroje veiklioji medžiaga sumažėja 25–29,4 %. Panaudojus vieną technologinių procesų – mėginių užšaldymą nustatyta, kad –20 °C temperatūroje taip pat sumažėjo veikliosios medžiagos. Po 15 parų laikymo užšaldytuose mėginiuose penicilino veikliosios medžiagos neberandama. Ištirta, kaip penicilino veiklioji medžiaga kinta biotechnologinių procesų metu. Nustatyta, kad vystantis pieno rūgšties bakterijoms, penicilino veiklioji medžiaga sumažėja iki 29,5 %, o penicilino veikliosios medžiagos sumažėjimas priklauso nuo pieno rūgšties bakterijų vystymosi intensyvumo. Intensyviau besivystančios pieno rūgšties bakterijos penicilino aktyviąją medžiagą ardo labiau.

Pagrindiniai žodžiai: pienas, technologiniai veiksniai, penicilinas, aktyvioji medžiaga, difuzijos į agarą metodas, pasterizacijos temperatūra, biotechnologiniai procesai, laikymas esant –20 °C ir +8 °C.

 

Įvadas

Maisto produktai gali būti užteršti įvairiais cheminės ir biologinės kilmės junginiais, kurie kelia pavojų žmogaus sveikatai. Į maistą kenksmingi junginiai patenka per orą, vandenį, dirvožemį ir gyvulininkystės bei augalininkystės produktus. Labai svarbu, kad įvairūs žmogaus organizmui kenksmingi junginiai nepatektų per kasdienius, dažniausiai vartojamus produktus. Vieni tokių – pieno produktai.

Į pieno produktus per pašarus gali patekti nitratai, pesticidai, sunkieji metalai ir kt. Gydant galvijus į pieną gali patekti antibiotikų likučiai. Nepaisant griežtos kontrolės, toks pienas pasiekia ir vartotoją.

Jie yra labai nepageidautini tiek produktų gamybos technologiniams procesams, tiek vartotojų sveikatai.

Vartojant pieno produktus su antibiotikų likučiais, žmogus be reikalo tampa antibiotikų vartotoju. Ligos atveju tos pačios grupės antibiotikai tampa neveiksmingi, nes bakterijos virsta jiems atspariomis Žr. Pieter Walstra, Tom J. Geurts, Ad Noomen et al., Dairy Technology, 1999; Rolanda Valintėlienė, „Antibiotikai – didžiulis medicinos išradimas ir nemenka problema“, 2006; Irena Narkevičiūtė, „Bakterijų atsparumo antibiotikams problemos“, 2008. . Šiuo metu žinoma, kad daugelyje Europos šalių antibiotikui eritromicinui bakterijų atsparumas siekia net iki 50 % Žr. Irena Narkevičiūtė, „Bakterijų atsparumo antibiotikams problemos“, 2008. . Be to, ligos atveju antibiotikai tampa neveiksmingi, žmogaus organizme jie gali sukelti disbakteriozę, alergiją, pykinimą, toksikozes ir kitas ligas Žr. Aukštakalnienė, 2006; Regina Žukauskienė, „Antibiotikai ir disbiozė: mitai ir tikrovė“, 2006. .

Antibiotikai stabdo pieno rūgšties bakterijų vystymąsi, fermentų veiklą. Esant jų likučiams piene sunku pagaminti kokybiškus pieno produktus bei fermentinius sūrius. Dėl to Lietuvoje nuolat vykdoma griežta antibiotikų kontrolė superkamame žaliaviniame piene.

 

Labai svarbu, kad po galvijų gydymo būtų išlaikytas atitinkamas periodas (tai laikas, kai su pienu nustoja išsiskirti antibiotikai). Šis laikas paprastai būna nurodytas vaistų naudojimo instrukcijoje. Neprisilaikant nurodyto (vartojant antibiotikus) laiko antibiotikų likučiai patenka į pieną. Ši problema yra ne tik Lietuvoje, bet ir kitose Europos šalyse. Dažniausiai randama penicilino likučių Žr. Renata Žvirdauskienė, Joana Šalomskienė, L. Urbšienė, „Inhibitorinių grupių nustatymas žaliame karvių piene mikrobiologiniais metodais“, 2004. . Penicilino likučių randama piene praėjus 5 paroms po paskutinio jo panaudojimo Žr. E. Skioeldebrand, A. Franklin, B. Olofsson et al., “Procaine Penicillin: An Evaluation of the Withholding Period for Milk,” 1994; L. R. A. Andrade, J. B. Figueiredo, J. L. F. H. A. Lins, “Evaluation of the Discharge of Antibiotic Residues in Milk after Medication with Penicillin and Streptomycin in Aqueous and Oily Formulations with Dimethyl Sulfoxide Adjuvant,” 1993. . Todėl Švedijos maisto veterinarinė tarnyba padidino pieno nesupirkimo laiką iki 12 parų po paskutinio antibiotiko (benzilpenicilino) panaudojimo Žr. Ulla Beckman-Sundh, “Extension of the Withholding Period for Benzylpenicillin Procaine Preparations,” 1994; H. Funke, “Time Course of Benzylpenicillin G Residues Excretion Into Milk,” 1994. .

 

Siekiant apsaugoti vartotojus nuo patekusių į pieno produktus antibiotikų jų nustatymui kuriami bei taikomi vis jautresni metodai. Dabar įvairiose šalyse penicilino nustatymui taikomi skirtingi metodai: aukšto slėgio chromatografijos bei kolorimetriniai metodai Žr. T. L. Šuliak, N. F. Korotchenko, «Sovershenstvovaniya metoda opredeleniya ingibiruyushchikh veshchestv v moloke», 2007; K. Rybińska, I. Karkocha, “Determination of Antibiotic Residues in Selected Foods of Animal Origin,” 1992. . Panaudojant aukšto slėgio skysčio chromatografą penicilino nustatymui pasiekiamas jautrumas yra 0,02 μg/l Žr. Ruriko Himei, Keiko Koide, Isao Tsuji, Seishi Yamamoto, Masakazu Horie, Sumiko Suzuki, Hiroyuki Nakazawa, “Simultaneous Determination of Penicillins and Sulfonamides in Milk by High Performance Liquid Chromatography,” 1993. . Labai didelio tikslumo pasiekiama nustatant penicilino likučius imunofermentinės analizės metodais Žr. E. Lochbihler, E. Usleber, G. Terplan, G. Engelhardt, P. Wallnoefer, “Enzyme Immunological Studies on the Occurrence of Antibiotics and Sulphonamides in Bavarian Consumer Milk,” 1995; Giampiero Scortichini, Loredana Annunziata, M. Naceur Haouet, F. Benedetti, I. Krusteva, Roberta Galarini, “ELISA Qualitative Screening of Chloramphenicol in Muscle, Eggs, Honey and Milk: Method Validation according to the Commission Decision 2002/657/ES Criteria,” 2005; Pierre Maris, Valérie Gaudin, “Report: Proficiency Study for the Analysis of Chloramphenicol Residues in Milk by ELISA,” 2002. . Pritaikius imunofermentinės analizės metodus (ELISA) penicilino nustatymo jautrumas siekia 0,005 TV/ml Žr. R. Jackman, J. Chesham, S. J. Mitchell et al., “Performance of a Rapid ELISA for Penicillin G in Milk,” 1990. . Tačiau šie tyrimai reikalauja didelio laboratorinio darbo imlumo, aukštos darbuotojų kvalifikacijos ir brangios įrangos.

 

Lietuvoje antibiotikų kontrolei yra taikomi ir imunofermentinės analizės (ELISA) metodas, mikrobiologiniai metodai, taip pat difuzijos į agarą metodas panaudojant specialias testavimo kultūras Žr. Renata Žvirdauskienė, Joana Šalomskienė, L. Urbšienė, „Inhibitorinių grupių nustatymas žaliame karvių piene mikrobiologiniais metodais“, 2004; Antanas Šarkinas, „Bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms priklausomybė nuo kultūrų fiziologinės būklės ir kultivavimo temperatūros“, 2005; Sigita Urbienė, Saulius Savickis, Aušra Steponavičienė, Marijus Stančikas, „Technologinių veiksnių įtaka chloramfenikolio kiekio kaitai gaminant pieno produktus“, 2009; Joana Šalomskienė, Renata Žvirdauskienė, „Inhibitorių žaliame karvių piene nustatymo problemos“, 2005. . Taikant difuzijos į agarą metodą dažniausiai naudojamos testavimo kultūros yra Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, ar Bacillus stearothermophilus Žr. Renata Žvirdauskienė, Joana Šalomskienė, L. Urbšienė, „Inhibitorinių grupių nustatymas žaliame karvių piene mikrobiologiniais metodais“, 2004. . Žinoma, kad kitose šalyse taip pat taikomi mikrobiologiniai metodai. Pavyzdžiui, Australijoje naudojamas standartas penicilino nustatymui piene ir pieno produktuose taikant mikrobiologinį difuzijos į agarą metodą (Bacillus stearothermophilus), matuojant susidariusias slopinimo zonas agaro terpėje Žr. Standards Association of Australia, 1991. . Teigiama, kad šio metodo tikslumas siekia 0,03 μg/l.

Kaip matyti, antibiotikų nustatymui žaliaviniame piene skiriama pakankamai dėmesio. Nepaisant to, žinomi atvejai, kai penicilino likučių aptinkama ir pieno produktuose. Tyrimų, kaip produktų gamybos technologinių procesų metu (jeigu antibiotikų netikėtai pateko į pieną) kinta įvairūs antibiotikai, labai mažai.

Lenkijoje ir JAV atlikti tyrimai rodo, kad kai kurių antibiotikų kiekiai gali sumažėti po terminio pieno apdorojimo arba veikiant atitinkamais fermentais Žr. D. Krasauskaitė, „Antibiotikai neigiamai veikia pieno produktų kokybę“, 1991. .

 

Žinomi tyrimai, kurių metu nustatyta penicilino likučio (0,3 TV), esančio piene, įtaka jogurto kokybei. Gauti rezultatai parodė, kad toks mažas penicilino aktyviosios medžiagos kiekis neturi įtakos jogurto technologinio proceso trukmei, konsistencijai bei skoniui Žr. A. Maciejska, B. Czarnocka-Roczniakowa, “Possibilities of Utilization of Penicillinase-Positive Strains of Micrococcus sp. in the Technology of Fermented Milk Products. III. Attempts to Utilize Penicillinase-Positive Strains of Micrococcus sp. for the Manufacture of Yohurt,” 1989. .

Taip pat tyrimais nustatyta, kad ne tik antibiotikai veikia pieno rūgšties bakterijas trukdydami joms vystytis, bet ir bakterijos gali sumažinti antibiotikų veikliąją medžiagą. Tačiau tokiam poveikiui turi būti atitinkamos sąlygos. Nustatyta, kad laikant pieną su penicilino likučiais ir bakterijomis šaltai (4 ir 10 °C temperatūroje) penicilino veikliosios medžiagos kiekis reikšmingai nesumažėjo. Tačiau laikant 30 °C temperatūroje penicilino veiklioji medžiaga sumažėjo labai ryškiai Žr. Claude P. Champagne, “Effect of Penicillin on Free or Immobilized Loctococci: Milk Acidification and Residual Antibiotic Level,” 1992. . Matyt, tai susiję su pieno rūgšties bakterijų atliekama fermentacija. Laikant 48 val. šaltai pieno rūgšties bakterijos nesivystė, todėl penicilino veikliajai medžiagai įtakos neturėjo, o laikant 30 °C temperatūroje 48 val. bakterijoms vystantis penicilino veikliosios medžiagos kiekis sumažėjo.

Keli darbai nustatant antibiotikų veikliosios medžiagos pokyčius technologinių procesų metu gaminant pieno produktus yra atlikti Lietuvos žemės ūkio universiteto (LŽŪU) Žemės ūkio produktų kokybės tyrimų laboratorijoje bendradarbiaujant su VĮ „Pieno tyrimai“ ir Kauno technologijos universiteto (KTU) Maisto instituto Mikrobiologijos laboratorija.

 

Imunofermentinės analizės metodu (ELISA), kurio tikslumas 0,01 ng/ml, buvo ištirtas antibiotiko chloramfenikolio kitimas pieno produktų gamybos metu (veikiant įvairiai terminio apdorojimo temperatūrai, laikant pieną 8 °C temperatūroje, raugiant pieno produktus ir kt.). Nustatyta, kad nei vienas technologinis procesas chloramfenikolio koncentracijos nepakeitė Žr. Sigita Urbienė, Saulius Savickis, Aušra Steponavičienė, Marijus Stančikas, „Technologinių veiksnių įtaka chloramfenikolio kiekio kaitai gaminant pieno produktus“, 2009. . Matyt chloramfenikolis pasižymi itin aukštu stabilumo laipsniu, ir temperatūros, mechaniniai bei biotechnologiniai poveikiai šio antibiotiko aktyvumo nepakeitė.

Kitas darbas atliktas siekiant nustatyti veikliosios tetraciklino medžiagos pokytį taikant mikrobiologinį metodą.

Difuzijos į agarą metodu buvo ištirta pieno gamybos technologinių veiksnių įtaka antibiotiko tetraciklino aktyviosios medžiagos pokyčiams. Pieno mėginiai, kuriuose tetraciklino aktyviosios medžiagos buvo 0,015 mg/ml, buvo veikiami tokiais technologiniais veiksniais: pasterizuojami keičiant pasterizacijos temperatūrą nuo 63 iki 85 °C, keičiamas laikymo laikas nuo 0 iki 25 min. esant 90 °C temperatūrai, laikomi 7–8 °C temperatūroje 72 val., užšaldomi (–20 °C) ir atšildomi (+10 °C), homogenizuojami bei rauginami. Nustatyta, kad visų technologinių procesų metu tetraciklino veiklioji medžiaga sumažėjo Žr. Sigita Urbienė, Antanas Šarkinas, Vytautas Jonavičius, „Pieno perdirbimo procesų įtakos tetraciklino aktyviajai medžiagai įvertinimas difuzijos į agarą metodu“, 2009. . Kadangi piene dažnai aptinkama penicilino likučių, todėl svarbu žinoti penicilino stabilumą technologinių procesų metu.

Šio darbo tikslas buvo taikant difuzijos į agarą metodą įvertinti pagrindinių pieno fizikinių-cheminių ir biotechnologinių veiksnių įtaką penicilino stabilumui, t. y. jo aktyviosios medžiagos pokyčiams.

 

Tyrimų sąlygos ir metodai

Darbas atliktas Lietuvos žemės ūkio universiteto Žemės ūkio produktų kokybės tyrimo laboratorijoje ir Kauno technologijos universiteto Maisto instituto Mikrobiologijos laboratorijoje 2009–2010 metais.

Tyrimams buvo naudotas šviežias pienas, gautas iš Lietuvos žemės ūkio universiteto bandomojo ūkio karvių fermos. Į pieno mėginius buvo dedami žinomi penicilino veikliosios medžiagos kiekiai.

Kadangi tyrimų tikslas buvo nustatyti, ar technologinių ir biotechnologinių procesų metu gali pakisti penicilino veiklioji medžiaga, todėl LŽŪU Žemės ūkio produktų kokybės tyrimų laboratorijoje pieno mėginiai (su žinomu penicilino veikliosios medžiagos kiekiu) buvo veikiami tokiais veiksniais:

  • laikomi 8 °C temperatūroje iki 72 val.;
  • pasterizuojami esant skirtingoms temperatūroms (63, 72, 80, 85 °C nelaikant);
  • pasterizuojami 85 °C temperatūroje nelaikant ir laikant mėginius iki 15 min.;
  • veikiami mechaniškai, panaudojant laboratorinį homogenizatorių (MPW-302), iki 5 min.;
  • keičiamos struktūrinės pieno koloidinės sistemos savybės mėginius užšaldant (–20 °C) ir juos atšildant (+10 °C);
  • laikant užšaldytus mėginius iki 30 parų;
  • vykdomi biotechnologiniai procesai su įvairiomis pieno rūgšties bakterijomis, panaudojant raugus, skirtus kefyro (DT 1000 l), jogurto (YC-380), rūgpienio (CHN-19) gamybai. Rauginimo procesas buvo vykdomas pridedant 5 % grynų pieno rūgšties bakterijų kultūrų raugo.
 

Tyrimams naudojami raugai buvo gauti iš Chr. Hansen laboratorijos (Danija).


LŽŪU Žemės ūkio produktų kokybės tyrimų laboratorijoje mėginiai su penicilino priedu, paveikti įvairiais technologiniais veiksniais, buvo atšaldomi iki +10 °C temperatūros ir toliau tiriami KTU Maisto instituto Mikrobiologijos laboratorijoje.

Technologinių veiksnių įtakai penicilino likučiams piene įvertinti taikytas difuzijos į agarą metodas ir dvi testavimo kultūros: Bacillus subtilis, Micrococcus luteus. Šie mikroorganizmai buvo parinkti kaip tinkami įvertinant penicilino aktyviosios medžiagos pokyčius.

Vertinant antibakterinį aktyvumą difuzijos į agarą metodu bakterijų kultūros 18 valandų auginamos 37 °C temperatūroje ant nuožulnaus agaro. Nuplauta bakterijų suspensija praskiedžiama pagal McFarland standartą nr. 0,5, gerai permaišoma minipustykle. Atitinkamas skaičius ląstelių supilama į ištirpintą ir atvėsintą iki 47 °C temperatūros agarizuotą terpę bendram mikroorganizmų skaičiui nustatyti, dar kartą gerai pamaišoma, kad ląstelės tolygiai pasiskirstytų. Tokiu būdu paruoštas bakterijų ląstelių suspensijos mišinys su terpe išpilstomas po 10 ml į 90 mm skersmens stiklines Petri lėkšteles. Terpei sustingus, joje padaromos 6 įdubos (8 mm skersmens), į kurias įpilama 50 μl tiriamojo pieno mėginio.

Mėginiai 24 valandas buvo laikomi 37 °C temperatūroje. Po to išmatuotos susidariusios skaidrios zonos.

 

Penicilino aktyviosios medžiagos pokytis vertinamas pagal antimikrobinį poveikį bakterijų kultūroms (Bacillus subtilis ir Micrococcus luteus) po 24 valandų, pagal skaidrių slopinimo zonų, susidariusių aplink įdubas, skersmenį, išreiškiamą milimetrais. Mažesnės skaidrios zonos, susidariusios aplink įdubas, reiškia, kad tirtos medžiagos koncentracija sumažėjusi ir ji daro mažesnį baktericidinį poveikį pasirinktoms Bacillus subtilis, Micrococcus luteus bakterijoms. Teigiama, kad penicilino likučių nustatymo metodo tikslumas yra 0,01 TV/g Žr. Antanas Šarkinas, D. Jasinauskaitė, „Kai kurių maisto produktų užterštumo inhibitoriais pakitimai“, 1997. .

Įvertinant penicilino aktyviosios medžiagos pokytį dėl įvairių technologinių veiksnių, slopinimo zonos nustatytos apskaičiuojant aritmetinį vidurkį iš 3-ų serijų pakartojimo.

Duomenys statistiškai apdoroti. Tam tikslui panaudota regresinė analizė.

Mėginių rodiklių skirtumų patikimumas (P) buvo nustatytas pagal Stjudento kriterijų. Kai kurių procesų tyrimų rezultatams apdoroti panaudota regresinė analizė.

Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas

Žaliaviniam pienui patekus į pieno perdirbimo įmonę vienas pirminių procesų yra atšaldyto pieno laikymas. Pienas gali būti atšaldytas iki 6–8 °C temperatūros.

Todėl pirmoje tyrimų dalyje buvo nustatyta atšaldyto pieno laikymo įtaka penicilino veikliosios medžiagos pokyčiui su testavimo kultūra Bacillus subtilis.

Į pieno mėginius buvo dėta skirtingas penicilino veikliosios medžiagos kiekis – nuo 40 iki 280 TV/100 ml pieno. Mėginiai ištirti prieš laikymą ir po laikymo 72 val. 8 °C temperatūroje.

 

Tyrimas buvo atliekamas panaudojant testavimo kultūrą Bacillus subtilis. Slopinino zonų skirtumas ištyrus mėginius prieš laikymą ir po 72 val. rodo, kad po laikymo slopinimo zonos sumažėjo (1 pav.).

1 pav. Pieno laikymo įtaka penicilino antimikrobiniam poveikiui (pagal slopinimo zonas su testavimo kultūra Bacillus subtilis, kai veikliosios medžiagos mėginiuose yra: 1 – 40 TV/100 ml; 2 – 200 TV/100 ml; 3 – 280 TV/100 ml; 4 – 480 TV/100 ml) / Fig. 1. Influence of milk storage on penicillin antimicrobial effect intensity (according to inhibition zones with Bacillus subtilis test culture at the antimicrobial substance quantity in samples: 1 – 40 TV/100 ml; 2 – 200 TV/100 ml; 3 – 280 TV/100 ml; 4 – 480 TV/100 ml)

Gauti rezultatai leidžia daryti neabejotiną išvadą, kad laikant pieno mėginius su penicilinu, jo veiklioji medžiaga sumažėja nuo 3,2 iki 10,3 %.

Tiesioginės priklausomybės tarp veikliosios medžiagos sumažėjimo ir jos kiekio pieno mėginiuose nenustatyta. Apskaičiavus veikliosios medžiagos sumažėjimą mėginiuose nuo 40 iki 280 TV/100 ml gauta, kad laikymo metu penicilino veikliosios medžiagos sumažėjimo vidurkis yra 6,6 %.

 

Analogiški rezultatai gauti ir su testavimo kultūra Micrococcus luteus.

Kita tyrimų dalis buvo skirta nustatyti pieno terminio apdorojimo įtakai penicilino veikliajai medžiagai. Esant skirtingoms temperatūroms (0, 63, 72, 80 °C) pasterizuoti mėginiai, kuriuose penicilino veikliosios medžiagos kiekis vienodas (15 TV/100 ml), buvo testuojami su dviem kultūromis (Bacillus subtilis, Micrococcus luteus). Gauti rezultatai (slopinimo zonų vidurkiai) parodyti 2 pav.

2 pav. Pasterizavimo temperatūros įtaka penicilino antimikrobiniam poveikiui su testavimo kultūromis B. subtilis ir M. luteus / Fig. 2. Impact of pasteurization temperature on the intensity of penicillin antimicrobial effect with B. subtilis and M. luteus test cultures

Tyrimų rezultatai rodo, kad naudojant abi testavimo kultūras slopinimo zonų skersmuo priklauso nuo temperatūros poveikio. Kuo temperatūra aukštesnė, tuo slopinimo zonų skersmuo mažesnis. Tai rodo, kad kuo aukštesnė temperatūra, tuo didesnė jos įtaka penicilino aktyviosios medžiagos kiekio sumažėjimui.

 

Gautų rezultatų analizė, įvertinant penicilino veikliosios medžiagos kiekio sumažėjimo zonas, pateikiama 1 lentelėje. Duomenų analizė atlikta kiekvienos pasterizacijos įtaką lyginant su nepasterizuotais mėginiais.

1 lentelė. Penicilino veiklioji medžiaga (%) esant skirtingoms pasterizavimo temperatūroms / Table 1. Reduction of penicillin active substance at different pasteurization temperature (%)
Pasterizavimo temperatūra °C
Pasteurization temperature, °C
Testavimo kultūra
Test culture
Bacillus subtilisMicrococcus luteus
Veikliosios medžiagos kiekio sumažėjimas %
Reduction of active substance content, %
Nepasterizuoti mėginiai
Non-pasteurized samples
0,000,00
6317,656,25
7223,5312,50
8029,4125,00

Matyti, kad didėjant pasterizavimo temperatūrai penicilino aktyvioji medžiaga yra slopinama gana efektyviai. Pasterizavus mėginius 80 °C temperatūroje su abiem testavimo kultūromis penicilino veiklioji medžiaga sumažėja iki 25–29,41 %.

Atskira tyrimų serija buvo skirta nustatyti temperatūros įtakai penicilino aktyviajai medžiagai poveikis, kai kinta (ilgėja) laikymo laikas esant tai pačiai temperatūrai. Penicilino veikliosios medžiagos mėginiuose buvo 15 TV/100 ml. Tuo tikslu buvo pasirinkta mėginių su penicilinu pasterizavimo 85 °C temperatūra laikant iki 15 min.

 
3 pav. Pasterizavimo 85 °C temperatūros su skirtingu laikymo laiku įtaka penicilino antimikrobinio poveikio sumažinimui naudojant testavimo kultūras B. subtilis ir M. luteus / Fig. 3. Influence of pasteurization at 85 °C with different keeping time on the reduction of penicillin antimicrobial effect with B. subtilis and M. luteus test cultures

Gauti rezultatai rodo, kad ilgėjant laikymo laikui slopinimo zonos mažėja. Palyginus kiekvieno mėginio su skirtingu laikymo laiku rezultatus su kontroliniu mėginiu (2 lentelė) matyti, kad ilgėjant laikymo laikui penicilino veikliosios medžiagos kiekio sumažėjimas (%) didėja. Mėginiuose, laikytuose 15 min. 85 °C temperatūroje, palyginti tik su pasterizuotais mėginiais, penicilino aktyviosios medžiagos sumažėja ~14 % su B. subtilis ir apie ~22 % su M. luteus.

 
2 lentelė. Penicilino veikliosios medžiagos sumažėjimas (%) esant tai pačiai (85 °C) temperatūrai, bet skirtingam temperatūros poveikio laikui / Table 2. Reduction of penicillin active substance at the same temperature (85 °C), but at different keeping time (%)
Pasterizavimo laikas min.
Pasteurization time, min
Testavimo kultūra
Test culture
Bacillus subtilisMicrococcus luteus
Veikliosios medžiagos kiekio sumažėjimas %
Reduction of active substance content, %
00,00,00
52,82,34
1010,017,65
1513,921,76

Gaminant įvairius pieno produktus pienas patiria nemažą mechaninį poveikį. Jis yra valomas (veikia separatorius – centrifuga), separuojamas (veikia separatorius), homogenizuojamas (veikiant dideliam slėgiui – iki 25 MPa). Keičiantis procesams pienas perduodamas siurbliais, taip pat mechaniškai veikiančiais pieną, todėl buvo svarbu nustatyti galimą mechaninį poveikį penicilino veikliajai medžiagai. Dėl to laboratorinėmis sąlygomis mėginiai su penicilinu buvo skirtingai paveikti mechaniškai: naudojamas laboratorinis homogenizatorius (MPV-302) ir keičiamas poveikio laikas nuo 1 iki 3 min. Penicilino aktyviosios medžiagos mechaninio apdorojimo tyrimui mėginiuose buvo 15 TV/100 ml.

 

Gauti rezultatai (4 pav.) rodo, kad dėl mechaninio poveikio sumažėja penicilino aktyviosios medžiagos kiekis.

4 pav. Mechaninio apdorojimo įtaka penicilino antimikrobiniam poveikiui su testavimo kultūromis Bacillus subtilis ir Micrococcus luteus kintant apdorojimo laikui / Fig. 4. Impact of mechanical processing on the intensity of penicillin antimicrobial effect with Bacillus subtilis and Micrococcus luteus test cultures at different processing time

Šis sumažėjimas priklauso nuo poveikio laiko. Didėjant poveikio laikui slopinimo zonų skersmuo mažėja. Mėginiuose po 3 min. apdorojimo (veikiant mėginius laboratoriniu homogenizatoriumi), palyginus su mechaniškai neapdorotais mėginiais, slopinimo zonos sumažėja 23,6 % (su B. subtilis) ir 12,5 % (su M. luteus). Iš gautų rezultatų galima spręsti, kad gaminant pieno produktus, kai būtina homogenizacija, mechaninis poveikis bus gerokai stipresnis negu veikiant mėginius laboratoriniu homogenizatoriumi. Todėl, reikia manyti, penicilino aktyvioji medžiaga bus ardoma intensyviau.

 

Gaminant valgomuosius ledus, sudarytas mišinys yra sušaldomas iki minusinių temperatūrų. Šioje gamyboje sušaldymo procesas yra vienas svarbiausių technologinių veiksnių. Todėl buvo atlikta serija bandymų, kurių metu nustatyta, ar pieno mišinio koloidinės sistemos pokyčiai užšalimo (iki –20 °C) ir atšildymo (iki +8 °C) metu veikia penicilino aktyviąją medžiagą. Tuo tikslu mėginiai su skirtingu penicilino veikliosios medžiagos kiekiu (1 – 80 TV/100 ml, 2 – 200 TV/100 ml, 3 – 800 TV/100 ml, 4 – 1 000 TV/100 ml) buvo padalyti į dvi dalis. Viena dalis buvo laikoma +8 °C temperatūroje, o kita – užšaldyta iki –20 °C temperatūros, palaikyta 24 val. ir atšildyta iki +8 °C temperatūros. Laikas nuo mėginio paruošimo iki penicilino veikliosios medžiagos nustatymo visuose mėginiuose buvo vienodas – 72 val. Antimikrobinio poveikio tyrimai buvo atlikti panaudojant testavimo kultūrą B. subtilis. Gauti rezultatai parodyti 5 pav.

5 pav. Užšaldymo iki –20 °C ir atšildymo iki +8 °C temperatūros įtaka penicilino antimikrobiniam poveikiui su testavimo kultūra B. subtilis / Fig. 5. Impact of freezing at –20 °C and defrosting at +8 °C on the intensity of penicillin antimicrobial effect with Bacillus subtilis test culture
 

Gauti rezultatai neabejotinai rodo, kad užšaldymas turi įtakos penicilino veikliajai medžiagai. Visuose užšaldytuose mėginiuose penicilino veikliosios medžiagos kiekis sumažėjo nuo 9,25 iki 20,3 %. Sumažėjimas buvo efektyvesnis, kai penicilino veikliosios medžiagos mėginiuose buvo mažiau.

Kadangi valgomieji ledai po pagaminimo ilgą laiką yra laikomi minusinėje temperatūroje, todėl svarbu ištirti, ar ilgo laikymo metu kinta penicilino aktyvioji medžiaga.

Mėginiai su 15 TV/100 ml penicilino aktyviosios medžiagos buvo užšaldyti iki –20 °C temperatūros ir laikomi 25 paras. Penicilino veikliosios medžiagos pokyčiai buvo stebimi visas 25 paras. Šie tyrimai buvo atlikti su dviem testavimo kultūromis B. subtilis ir M. luteus.

Tyrimų rezultatai parodyti 6 pav.

6 pav. Užšaldytų (–20 °C temperatūroje) mėginių laikymo įtaka penicilino antimikrobiniam poveikiui su testavimo kultūromis B. subtilis ir M. luteus / Fig. 6. Influence of storage of frozen (–20 °C) samples on the intensity of penicillin antimicrobial effect with Bacillus subtilis and Micrococcus luteus test cultures

Matyti, kad laikant užšaldytus mėginius penicilino veiklioji medžiaga palaipsniui mažėja. Po 15 parų laikymo penicilino likučių, taikant difuzijos į agarą metodą, nebeįmanoma aptikti. Iš gautų rezultatų galima padaryti išvadą, kad laikant mėginius minusinėje temperatūroje penicilino veiklioji medžiaga suyra.

 

Dar viena tyrimų serija buvo atlikta siekiant nustatyti biotechnologinių procesų poveikį (t. y. pieno rūgšties bakterijų vystymosi įtaką) penicilino aktyviajai medžiagai. Tam tikslui pasiekti pieno mėginiai su skirtingais raugais buvo rauginami iki rūgštinės struktūros susidarymo. Penicilino aktyviosios medžiagos tyrimai buvo atliekami mėginiuose prieš rauginant ir po jo.

Šioje tyrimų serijoje taip pat buvo naudojamos abi testavimo kultūros (B. subtilis ir M. luteus). Tyrimų rezultatai (7 pav.) rodo, kad po surauginimo (po 24 val.) penicilino veikliosios medžiagos sumažėjo.

7 pav. Pieno rūgšties bakterijų vystymosi įtaka penicilino antimikrobiniam poveikiui su testavimo kultūromis: a Bacillus subtilis, b Micrococcus luteus. Mėginiai: 1 – kontroliniai prieš rauginimą; 2 – su kefyro raugu (DT 1 000 l); 3 – su rūgpienio raugu (YC-380); 4 – su CHN-19 raugu / Fig. 7. Influence of the development of lactic acid bacteria on the intensity of penicillin antimicrobial effect with Bacillus subtilis and Micrococcus luteus test cultures. Samples: 1 – tests before fermentation; 2 – samples with kefir ferment (DT 1 000 l); 3 – samples with sour milk ferment (YC-380); 4 – samples with CHN-19 ferment
 
Sumažėjimo procentas priklausė nuo raugą sudarančių pieno rūgšties bakterijų. Išanalizavus tyrimų rezultatus su testavimo kultūra B. subtilis (7 pav., a) gauta, kad vystantis kefyro raugą (DT 1 000 l) sudarančioms mezofilinėms bakterijoms penicilino aktyviosios medžiagos sumažėjo tik 5,9 %, vystantis jogurtinį raugą (YC-380) sudarančioms termofilinėms bakterijoms – 11,8 %. Analogiškas poveikis penicilino aktyviajai medžiagai gautas ir su raugu CHN-19 (7 pav., a). Panaudojus testavimo kultūrą Micrococcus luteus (7 pav., b) nustatyta, kad penicilino aktyvioji medžiaga, palyginti su B. subtilis, paveikiama kur kas efektyviau: kefyro raugu DT 1 000 l – 17,7 %, YC-380 raugu – 17,7 % ir raugu CHN-19 – 29,5 %.

Iš literatūros analizės žinoma, kad pieno rūgšties bakterijos skaldo toksiškas medžiagas (mikotoksinus, nitratus, nitritus ir kt.) Žr. Ina Jasutienė, Galina Garmienė, Meilė Kulikauskienė, „Aflatoksino M1 stabilumas jogurto gamybos metu: nustatymas imunofermentinės ir skysčių chromatografijos metodu“, 2003; Sigita Urbienė, J. Stankevičiūtė, „Sausųjų išrūgų priedo įtaka denitrifikacijos procesams raugintuose pieno produktuose“, 2003; Sigita Urbienė, Maisto toksikologijos pagrindai, 2010; Sigita Urbienė, Antanas Šarkinas, Vytautas Jonavičius, „Pieno perdirbimo procesų įtakos tetraciklino aktyviajai medžiagai įvertinimas difuzijos į agarą metodu“, 2009. , todėl penicilino veikliosios medžiagos kiekio sumažėjimas vystantis pieno rūgšties bakterijoms, nustatytas su testavimo kultūromis B. subtilis ir M. luteus, papildė žinomus literatūros duomenis. Be to, tyrimų rezultatai rodo, kad nustatytos slopinimo zonos priklauso nuo pieno rūgšties bakterijų vystymosi intensyvumo, kurį netiesiogiai parodo mėginiuose rauginimo procesu susidariusi pieno rūgštis. Mėginiuose su raugu DT 1 000 l pieno rūgšties buvo mažiausiai (0,33 %), o su raugu CHN-19 – daugiausiai (0,48 %).

Siekiant tiksliau nustatyti pieno rūgšties bakterijų vystymosi poveikį penicilino veikliajai medžiagai ir paaiškinti 7 pav. parodytus rezultatus (skirtumus tarp testavimo kultūrų) buvo nustatyta pieno rūgšties bakterijų vystymosi surauginant mėginius be penicilino įtaka testavimo kultūroms.